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《贵州师范大学》 2017年
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合江棘蛙Cathelicidins家族抗菌肽CATH PR1-2的原核表达

陈晨  
【摘要】:Cathelicidin家族抗菌肽是哺乳动物免疫防御系统中重要的抗菌肽家族之一,因其具有广谱及高效的抑菌活性成为抗菌肽研究热点之一,目前已发现了一百多种来源于不同生物的Cathelicidin家族抗菌肽,其中两栖类动物中关于该家族的研究开展得最晚。两栖类薄弱的物理屏障使其置于危险的环境当中,其皮肤作为先天性免疫防御系统的第一道防线对两栖类的生存至关重要,抗菌肽作为其皮肤分泌的大量生物活性物质之一,是其先天性免疫系统的重要组成部分。Cathelicidin家族抗菌肽由三部分:N端信号肽区域、cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成,经特定的蛋白酶切作用后暴露出其成熟肽区域,成为有活性的抗菌肽从而发挥其生物学作用。前期研究中我们已经通过基因克隆的方法从合江棘蛙的皮肤当中得到了两条Cathelicidin家族抗菌肽,分别命名为Cathelicidin-PR1和Cathelicidin-PR2(以下简称CATH PR1和CATH PR2);研究表明:CATH PR1和CATH PR2的成熟肽区域分别含有29个氨基酸残基(RKCNLFCKAKQKLKSLSSVIGTVVHPPRG)和25个氨基酸残基(KECKDYLCKLLMKLGSSSHIESIDP);对其抑菌活性进行验证发现CATH PR1具有较强的抑菌活性,尤其是对某些临床的耐药菌株,而CATH PR2对所有供试菌株并未显示出抑菌作用。然而,天然提取或化学合成抗菌肽对成本和技术的要求均较高,且仅适用于科学研究,不适合抗菌肽的大批量生产,因此本研究参考了近几十年研究较为广泛的基因工程技术,目的在于利用大肠杆菌原核表达系统表达抗菌肽,由于CATH PR1和CATH PR2的分子量比较低,分别为3195.88和2838.34 Da,因此我们将CATH PR1和CATH PR2串联起来得到新型抗菌肽CATH PR1-2,在CATH PR1-2的序列前后分别加入酶切位点,用相同的酶处理质粒pET-32a之后,将酶切产物连接,重组质粒导入表达菌株大肠杆菌BL21当中,通过诱导剂IPTG诱导表达,获得稳定表达的融合多肽CATH PR1-2;经镍柱亲和层析纯化,将杂蛋白与目的蛋白分离;经甲酸切割等手段,初步得到重组蛋白CATH PR1-2;用白色念珠菌08030102对该重组蛋白进行抑菌活性检测,结果显示:重组蛋白CATH PR1-2与CATH PR1一样,对该菌有一定的抑制作用。本研究通过构建原核表达载体的方式成功得到了具有一定生物活性的重组蛋白CATH PR1-2。
【学位授予单位】:贵州师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q51

【参考文献】
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