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《广西医科大学》 2011年
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白花丹素诱导体外大鼠肝细胞损伤及改构型酸性成纤维细胞生长因子对其保护作用的实验研究

徐雅玲  
【摘要】:目的:研究白花丹素对肝细胞增殖的抑制作用及改构型酸性成纤维细胞生长因子(MaFGF)是否对白花丹素(Plumbagin)引起的肝细胞损伤有保护作用。初步探讨白花丹素的毒性与MaFGF的保护作用机制,为其进一步的开发利用提供实验依据和理论基础。 方法:通过剥离1d左右的SD大鼠肝脏被膜以及剪碎的方法得到1mm3大小的组织块。然后,将这些组织块先以37℃预先复温30min至1h的0.25%胰蛋白酶吹打消化3min左右,后以0.1%胶原酶消化10min并以离心的方法获取较为纯净的肝细胞,加以含10% FBS的DMEM-HG吹打制成较均匀细胞悬液接种于经无菌处理的孔板或培养瓶内。采用PAS糖原染色的方法鉴定体外培养的肝细胞:以淀粉酶预先作用细胞取得对照组染色结果。取实验组的多个视野进行阴性和阳性细胞记数,结果显示阳性细胞数占95%,达到后续实验要求。将阳性细胞的覆盖率达到实验要求的肝细胞接种于96孔培养板:(1)在培养液中加入一系列浓度的MaFGF,培养24h后用MTT法检测细胞的活力。(2)培养72h后加入一系列浓度的白花丹素,实验组在白花丹素作用24h后加入不同浓度MaFGF,再培养24h后用MTT法检测细胞存活率。(3)以白花丹素建立损伤模型,并在加药后24h加入一定量的MaFGF,观察MaFGF对白花丹素诱导的肝细胞损伤保护作用。应用SPSSl3.0软件进行统计分析,采用方差分析、t检验进行统计学处理,取a=0.05为显著性检验水准。 结果:(1)在倒置相差显微镜下观察到细胞呈典型上皮细胞样的多角形形态;经PAS糖原染色法鉴定,可以看到胞质中充满粉红色糖原颗粒,胞核不显色而呈空泡状的细胞则为阳性细胞;经淀粉酶消化后的的细胞,胞浆呈无色,为阴性细胞。(2)肝细胞增殖活性检测:低浓度(3.12μg/L) MaFGF组与对照组比较无显著性差异(P0.05);而加入(4.68~7.80μg/L)MaFGF的各组与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05),但是(4.68~7.80μg/L)MaFGF的各组间比较差异无统计学意义(P0.05)。(3)不同浓度的白花丹素对肝细胞的抑制率随药物浓度的增大而增加。(4)白花丹素+不同浓度的MaFGF对肝细胞的抑制率随MaFGF浓度的增大而减小;IC50随着MaFGF浓度的增大而明显增高,并呈现比较明显的剂量-效应特点。(5)白花丹素组与对照组比较,各生化和酶学指标差异均有显著性(P0.01或0.05);白花丹素+MaFGF组与白花丹素组比较,SOD活性升高、NO、MDA、LDH、GPT、GOT下降差异有显著性(P0.01或P0.05)。而白花丹素+MaFGF组与对照组比较,各生化和酶学指标活性或含量均未回落至正常水平,差异仍有统计学意义(P0.01或P0.05)。 结论:①采用胰酶+胶原酶消化法和酶消化组织块法,并经PAS糖原染色法鉴定,证实成功分离培养出肝细胞。 ②MaFGF在一定浓度内对肝细胞生长有促增殖的作用,但不呈浓度-效应特点。 ③成功建立白花丹素致肝细胞损伤的模型:白花丹素能显著抑制肝细胞的增殖,抑制效应与白花丹素的浓度相关。 ④MaFGF对白花丹素诱导的肝细胞损伤有一定的保护作用,且保护效应呈浓度依赖型。
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5;R346

【参考文献】
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