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《湖北民族学院》 2018年
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壶瓶碎米荠无性繁殖体系的建立和ChST2A基因的克隆

吴美儒  
【摘要】:人体所必需的微量元素硒是硫的同主族元素,与硫元素有相似的化学性质,在植物体内共享大部分吸收代谢途径。植物利用3'-磷酸腺苷5'-磷酰硒酸盐(PAPSe)作为供体将硒酸根转移到含羟基生物分子上被称硒化(Selenation),其化学性质和过程与磺化(Sulfonation)类似。磺基转移酶(Sulfotransferase,ST)是催化植物体内磺化过程的关键酶,以3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸盐(PAPS)作为磺基供体磺化含羟基生物分子。通过对超聚硒植物壶瓶碎米荠(Caradamine hupingshanensis)转录组测序和转录组差异分析发现其ChST2A基因对高浓度硒十分敏感,结合ST家族基因的功能和前期基础研究结果,推断ChST2A可能参与壶瓶碎米荠体内硒化作用。为研究ChST2A在壶瓶碎米荠硒化作用中的功能,首先建立壶瓶碎米荠无性繁殖体系,再克隆ChST2A序列,进行初步生物信息学分析后,原核表达后纯化了 ChST2A表达产物,并研究了纯化条件。主要研究及得到的结论如下:1、壶瓶碎米荠无性繁殖体系建立。1)壶瓶碎米荠愈伤组织的诱导。以无菌苗的根、茎、叶为外植体,以MS培养基为基础培养基,用TDZ、6-BA、NAA和2,4-D等植物激素诱导愈伤组织。结果发现:①用四种不同培养基组合的诱导效率大小为TDZ+NAA6-BA+NAATDZ+2,4-D6-BA+2,4-D;②MS+TDZ(0.8 μg/mL)+NAA(0.4 μg/mL)的诱导率最高为89.37%;③壶瓶碎米荠的苗龄对愈伤组织的诱导有明显的影响,随着苗龄的增长愈伤组织死亡率和褐化率相应的增加,最高可达到46.75%和64.94%;④不同器官外植体愈伤组织的诱导率不同,叶片和茎相对于根的诱导率极显著性的增加,分别达到了 75.25%和52.45%。2)不定芽诱导。去皮无菌种子和愈伤组织培养于MS培养基中,前者加TDZ和NAA,后者加TDZ、NAA和6-BA,以诱导不定芽。结果表明:MS+TDZ(0.4 μg/mL)+NAA(0.3 μg/mL)浓度下壶瓶碎米荠种子的分化率最好可达到79.54%;愈伤组织在培养基 MS+TDZ(0.4 μg/mL)+NAA(0.4 μg/mL)+6-BA(1μg/mL)中更利于不定芽分化。3)不定芽生根。以MS培养基为基础培养基,用不同浓度NAA、IBA、蔗糖、培养基探索壶瓶碎米荠不定芽生根。结果表明:在1/2MS+IBA(1.5 μg/mL)时平均生根条数最高为10.5条/瓶,1/2MS+IBA(1.0μg/mL)时平均根长可达到最高为12.42 mm/根、生根指数为4.63。2、壶瓶碎米荠ChST2A基因的克隆利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆ChST2A全长cDNA,用Contig Express软件将片段拼接完整。再用RT-PCR法扩增全长ChST2A,测序后利用MEGA7.0软件最大似然法进行系统发育树分析,用GENSCAN分析开放阅读框架,使用 ProtParam、PSORT Ⅱ Prediction、ProtScale、NetPhos 2.0 Server、BioEdi、SignalP4.1Server、TMHMMServerv.2.0等在线软件对理化性质、亲水性质、亚细胞定位和跨膜结构、信号肽分析,使用SOPM、SWISS-MODEL和Maestro对空间结构和活性中心预测。结果表明:1)分子系统发育分析发现ChST2A与AtST2A亲缘关系最近,故将壶瓶碎米荠的磺基转移酶重新命名为ChST24;2)该基因全长1797bp,开放阅读框架编码了 365个氨基酸,3'和5'非翻译区分别有377bp和322bp;3)ChT2A蛋白质的分子大小为42.08kDa,理论等电点为8.09,共有40个可能的磷酸化位点,无跨膜结构域和信号肽,该蛋白是一个定位于细胞质中的亲水蛋白,具有磺基转移酶家族高度保守的四个特征结构区域;4)由于拟南芥中的AtSOT18基因的蛋白模型(5MEK.1)的结构最为相似,并在此基础上进行了三级结构建模,酶活性中心分析发现其催化位点为Lys105、Thr108、Thr109、His172,PAP 的结合位点为 Lys105、Gly107、Thr108、Thr109、Trp110、Arg194、Ser202、Tyr260、Arg326、Lys327 和 Gly328。3、ChST2A原核表达与产物纯化将克隆的ChST2A按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子改造,与载体pET-30a构建超表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)。16℃的条件下IPTG诱导工程菌16小时,超声破碎细胞收集上清和沉淀,SDS-PAGE电泳分析重组蛋白分子量。结果表明:该工程菌能成功表达ChST2A,以包涵体表达在沉淀中,SDS-PAGE分析该蛋白分子量为42k左右;用Ni2+凝胶柱亲和层析洗脱的最适咪唑浓度为60 mM,其蛋白质的含量可达到50 mg/L。
【学位授予单位】:湖北民族学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.1;Q943.2

【参考文献】
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