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《上海海洋大学》 2018年
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基于RNA-Seq技术鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型编码的功能miRNA及miR-C12调控细胞凋亡研究

鲁建飞  
【摘要】:1.异育银鲫尾鳍细胞系的建立及其对CyHV-2的敏感性研究本实验中,我们建立了异育银鲫尾鳍细胞系,命名为GiCF。原代培养的GiCF细胞形态多样,主要呈上皮样细胞和纤维样细胞的特点,稳定传代后细胞呈纤维样细胞的特点。该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长,最适生长温度为25℃。染色体数目分布在140-166之间,有35%的中期分裂相的染色体纵数在156,3n=156为三倍体。用从患病异育银鲫肾脏和脾脏中提取的病毒悬液感染GiCF细胞,7天后细胞出现明显的病变现象,细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化;感染9天后,病变现象更加明显,出现大量的细胞脱落现象。用传至20代的CyHV-2感染细胞,细胞病变情况更加严重,感染7天后,细胞大量脱落、死亡,证明GiCF细胞对CyHV-2敏感,可用于CyHV-2的增殖。另外,CyHV-2感染GiCF细胞后出现明显的凋亡小体,TUNEL染色也能观察到明显的凋亡阳性信号,AnexinⅤ/PI染色结果表明病毒感染后发生凋亡细胞的数量显著上升。说明CyHV-2感染能引起GiCF细胞产生凋亡。2.CyHV-2感染异育银鲫m RNA转录组和小RNA转录组研究利用Illumine Hiseq 2500测序平台构建了健康组(T1K,T2K,T3K)和濒死组(T4K,T5K,T6K)异育银鲫肾脏的6个m RNA文库和6个s RNA文库。6个m RNA转录组文库中,共获得564,633,312纯净reads,经Trinity拼接一共获得了20,386条平均长度为647 bp的unigene。6个s RNA文库中,共获得9,652,774纯净reads,经比对分析得到888个成熟的miRNA,其中48个为新发现的miRNA,且这些新发现的miRNA表达量相对较低。对所有的miRNA进行差异表达分析,有23个差异表达miRNA(P0.01),其中8个miRNA表达量显著上调,15个miRNA显著下调。用q RT-PCR实验验证显著差异表达的miRNA,表达变化趋势与测序结果基本一致。最后,对显著差异表达的miRNA进行靶基因预测,大部分miRNA有多个靶基因,一个靶基因可能受到多个miRNA共同调控,这些靶基因参与多种信号途径,如Jak-STAT信号通路、B细胞受体信号通路、凋亡和MAPK信号通路等。3.CyHV-2编码miRNA的鉴定及功能分析利用小RNA转录组数据,结合CyHV-2基因组信息,分析得到17条CyHV-2编码的miRNA,这些miRNA的前体具有良好的发卡结构。CyHV-2编码miRNA在病毒基因组上主要成簇状分布在两个区域,其中一个位于ORF42附近,包括mi R-C3,mi R-C4,和mi R-C5,另外一个区域位于ORF114附近,包括mi R-C1,mi R-C15,和mi R-C16。在CyHV-2感染过程,使用q RT-PCR检测肾脏组织中CyHV-2的拷贝数,发现感染后病毒拷贝数持续升高,感染72 h时病毒的拷贝数达到107.6copies/ml。随着CyHV-2感染的进行,PIN1和NF-κB的m RNA表达显著下降,而MHC-I,IRF3和MAPK7基因的m RNA表达显著上调。随后我们利用Stem-loop q RT-PCR检测到除了mi R-C3,mi R-C8,mi R-C16之外的14个病毒miRNA,其中mi R-C4和mi R-C5表达量最高;利用Northern blot检测8个丰度较高的miRNA时,检测到所有的8个pre-miRNA,只检测到mi R-C4和mi R-C5 2个miRNA的成熟体。利用荧光素酶报告系统证明mi R-C4能与ORF4、IRF3、RBMX和PIN1基因的3′UTR区域直接结合,而IRF3、RBMX和PIN1是RIG-I信号通路上的重要基因,我们推测CyHV-2通过编码miRNA参与调控RIG-I信号通路,从而逃避宿主的免疫反应。4.miR-C12通过下调caspase 8的表达抑制CyHV-2诱导的细胞凋亡既然CyHV-2能够诱导GiCF细胞发生凋亡,我们希望探讨CyHV-2编码的miRNA是否参与调控细胞凋亡。将8条表达丰度较高的miRNA mimics转染至GiCF细胞后,发现mi R-C10和mi R-C12抑制CyHV-2诱导的GiCF细胞凋亡,mi R-C4促进CyHV-2诱导的GiCF细胞凋亡。通过生物信息学预测及双荧光素酶报告实验,证明mi R-C12靶向抑制内源及外源表达的caspase 8基因。CyHV-2感染GiCF细胞后,caspase 8 m RNA和蛋白表达水平都显著上调,感染6 h后即可检测到mi R-C12,且表达量随着感染时间的延长而增高。然后我们分别用si RNA或Z-IETD-FHM抑制caspase 8,都能下调CyHV-2诱导的细胞凋亡。CyHV-2感染后,再转染mi R-C12 mimics将导致GiCF细胞的凋亡水平显著下调,转染mi R-C12inhibitor导致GiCF细胞凋亡水平显著上调。以上结果表明,在感染过程中,CyHV-2通过编码mi R-C12抑制细胞凋亡。为进一步探讨mi R-C12在病毒侵染过程中的调控机制,将mi R-C12 mimics,mi R-C12 inhibitor,CASP-si RNA-1和相应的对照物转染细胞,结果显示转染mi R-C12 mimics和CASP-si RNA-1均能促进CyHV-2的复制,转染mi R-C12 inhibitor抑制CyHV-2的复制。由此我们推测CyHV-2通过编码mi R-C12抑制病毒诱导的细胞凋亡,进而促进病毒在细胞内复制。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S941.41

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 蔡珍珍;贾仁勇;;疱疹病毒microRNAs功能的研究进展[J];病毒学报;2015年06期
2 陈昌福;冯东岳;陈辉;方苹;倪金俤;;异育银鲫疱疹病毒病被动免疫的初步研究[J];当代水产;2015年10期
3 陈昌福;陈辉;胡明;方苹;李景;刘训猛;袁锐;;异育银鲫疱疹病毒病及其防控对策(下)[J];当代水产;2015年05期
4 陈昌福;陈辉;胡明;方苹;李景;刘训猛;袁锐;;异育银鲫疱疹病毒病及其防控对策(上)[J];当代水产;2015年04期
5 孟思妤;孟长明;陈昌福;;异育银鲫疱疹病毒病及其防控对策(1)[J];渔业致富指南;2015年06期
6 李登云;张德礼;;病毒编码miRNA与宿主免疫[J];中国免疫学杂志;2014年04期
7 徐进;曾令兵;杨德国;张辉;马杰;江南;范玉顶;;鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定[J];中国水产科学;2013年06期
8 李莉娟;罗杨志;刘学芹;顾泽茂;袁军法;;金鱼鲤疱疹病毒Ⅱ型的分子诊断[J];华中农业大学学报;2013年01期
9 薛白;王树芬;鲍登克;邓瑞广;李学伍;;动物病毒microRNA的研究进展[J];河南农业科学;2012年06期
10 田飞焱;何俊强;王璐;刘荭;;金鱼疱疹病毒性造血器官坏死病研究进展[J];中国动物检疫;2012年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 于力;王津津;史秀杰;郑晓聪;贾鹏;兰文升;刘荭;;鲤科疱疹病毒2型Taqman实时荧光PCR方法的建立[J];中国动物检疫;2015年10期
2 贾洛;顾泽茂;柳阳;郭庆祥;李丹;翟艳花;;洪湖碘泡虫多克隆抗体的制备及免疫特性分析[J];华中农业大学学报;2015年06期
3 俞军;孙琪;王会聪;蒋新益;胡鲲;杨先乐;黄保华;;聚六亚甲基胍对异育银鲫造血器官坏死症的防治效果研究[J];淡水渔业;2015年04期
4 邓院生;方进;王俊;周莉;朱蓉;;一株致病性异育银鲫源维氏气单胞菌的分离鉴定[J];水产学杂志;2015年02期
5 李茂;肖丹;刘天强;刘衍鹏;黄冠军;汪开毓;罗远会;;鲤科疱疹病毒Ⅱ型射阳株的分离与鉴定[J];淡水渔业;2015年03期
6 罗丹;梁利国;谢骏;吴旭东;;鲤疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型研究进展[J];水生态学杂志;2014年03期
7 罗丹;梁利国;谢骏;吴旭东;;2型鲤疱疹病毒双重PCR快速检测方法的建立及应用[J];中国预防兽医学报;2014年05期
8 徐进;曾令兵;杨德国;张辉;马杰;江南;范玉顶;;鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定[J];中国水产科学;2013年06期
9 李莉娟;罗杨志;刘学芹;顾泽茂;袁军法;;金鱼鲤疱疹病毒Ⅱ型的分子诊断[J];华中农业大学学报;2013年01期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李莉娟;罗杨志;刘学芹;顾泽茂;袁军法;;金鱼鲤疱疹病毒Ⅱ型的分子诊断[J];华中农业大学学报;2013年01期
2 肖艺;曾令兵;徐进;周勇;;锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性[J];中国细胞生物学学报;2012年08期
3 田飞焱;何俊强;王璐;刘荭;;金鱼疱疹病毒性造血器官坏死病研究进展[J];中国动物检疫;2012年04期
4 罗俊;滕蔓;樊剑鸣;王方雨;周玲;邓瑞广;张改平;;马立克氏病病毒编码的microRNA:从基因组学到功能研究[J];中国科学:生命科学;2010年06期
5 曹国君;孙佳彬;季育华;;病毒microRNA研究进展[J];上海交通大学学报(医学版);2010年04期
6 ;Virus-Encoded microRNAs: Future Therapeutic Targets?[J];Cellular & Molecular Immunology;2006年06期
7 李伟,金由辛;miRNA的生物合成过程[J];生物化学与生物物理进展;2005年08期
8 陈贵海,周江宁,王明丽;人巨细胞病毒潜伏感染机制研究新进展[J];病毒学报;2004年04期
9 李霞,福田颖穗;金鱼疱疹病毒敏感细胞的体外培养[J];上海水产大学学报;2003年01期
10 李祥敏,金梅林,陈焕春;疱疹病毒潜伏感染与细胞凋亡关系的研究进展[J];动物医学进展;2001年04期
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1 张沛;高春林;夏正坤;;环形RNA与相关疾病研究进展[J];中华临床医师杂志(电子版);2018年09期
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6 郭岱昀;;RNA药物的研发现状[J];中国处方药;2019年02期
7 龙志;谢娟;李国庆;;环状RNA在人类疾病中的研究进展[J];西南军医;2018年01期
8 成星宇;申洪;;环状RNA在肺癌研究中的进展[J];中国肺癌杂志;2018年01期
9 房树志;房远;;环状RNA与癌症关系的研究进展[J];生物技术通讯;2018年01期
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张畅斌;尹爱华;何天文;王波;邓文喻;赖有行;;一种经济便捷的手足口病原RNA提取方法[A];广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会论文及摘要汇编[C];2014年
2 李园园;陆俊梅;程松;崔振玲;;RNA恒温扩增实时检测技术鉴定鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌[A];第四届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2013年
3 Jingrong Wang;Junping Kou;Hilda Yau;Wanrong Zong;Tongmeng Yan;Zhi-Hong Jiang;;Protective Effect and Sequences of RNA Fragments from Ginseng's Larger RNAs against Myocardial Ischemia Injury in Mice[A];中国化学会第十一届全国天然有机化学学术会议论文集(第一册)[C];2016年
4 郭晓强;张巧霞;黄卫人;蔡志明;;长链非编码RNA与肾细胞癌发生[A];遗传多样性:前沿与挑战——中国的遗传学研究(2013-2015)——2015中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2015年
5 吴建军;李勋;黄锦坤;杨倜;徐益勤;杨巧媛;蒋义国;;环境化学物暴露血液非编码RNA标志物研究[A];中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集[C];2015年
6 李成云;梁戈玉;姚文卓;隋静;申娴;张艳秋;马书梅;尹立红;浦跃朴;;胃癌相关长链非编码RNA的鉴定及肿瘤标志物的筛选研究[A];中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛论文集[C];2015年
7 徐勇;张付全;张克让;Yin Yao Shugart;;精神分裂症中转录因子-微小RNA交互调控网络的异常[A];中华医学会第十三次全国精神医学学术会议论文汇编[C];2015年
8 韩艳华;陈红印;张礼生;;RNA干扰技术在昆虫滞育机制研究中的应用[A];植保科技创新与农业精准扶贫——中国植物保护学会2016年学术年会论文集[C];2016年
9 王小利;吴佳海;舒健虹;牟琼;;高羊茅光周期调控基因RNA干扰表达载体构建[A];中国草学会2013学术年会论文集[C];2013年
10 魏任雄;;长链非编码RNA与男性不育的研究进展[A];中华中医药学会第十四次男科学术大会论文集[C];2014年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 中科院上海生科院上海植物生理生态所 毛颖波;寻找小RNA世界里的另一道风景[N];科学时报;2011年
2 记者 耿挺;RNA剪接基因编辑新方法[N];上海科技报;2018年
3 记者 聂翠蓉;基因检测“神探夏洛克”问世[N];科技日报;2017年
4 本报记者 聂翠蓉;让RNA处理器在活细胞中“奔腾”[N];科技日报;2017年
5 记者 毛黎;脂质分子可提高RNA干扰技术效率[N];科技日报;2009年
6 记者 张小军;RNA:被忽视的“遗传信使”[N];新华每日电讯;2002年
7 记者 陈勇;美科学家发现非典病毒特异RNA片段[N];新华每日电讯;2004年
8 王小京;HIV RNA在全脂母乳中含量最高[N];中国医药报;2004年
9 记者 聂翠蓉;细胞“垃圾”也能变废为宝[N];科技日报;2008年
10 冯卫东 王小龙;英在地球早期环境模拟条件下合成类RNA[N];科技日报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王小辉;EV71感染与应激颗粒以及RNA代谢通路之间的关系研究[D];南京大学;2015年
2 周劲旭;环状RNA芯片联合组织芯片技术对脑胶质母细胞瘤特征性靶标hsa_circ_0008344的研究[D];安徽医科大学;2018年
3 贺莎;对长链非编码RNA序列、进化与种系特异性的计算研究[D];南方医科大学;2015年
4 鲁建飞;基于RNA-Seq技术鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型编码的功能miRNA及miR-C12调控细胞凋亡研究[D];上海海洋大学;2018年
5 樊晓旭;RNA干扰在哺乳动物抗野田村病毒先天性免疫作用机制研究[D];中国农业大学;2015年
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1 陈承晓;十字花科黑腐病菌六个小RNA的功能鉴定[D];广西大学;2012年
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5 许文舒;CRISPR-Cas9导向RNA对人抑癌基因p53与PTEN的编辑靶点筛选与效率验证[D];吉林大学;2018年
6 孙伟虹;基于RNA-Seq技术的毕赤酵母长链非编码RNA的预测与鉴定[D];江南大学;2018年
7 马立;基于位置权重矩阵的长非编码RNA预测方法研究[D];西南大学;2018年
8 李享云;蛋白质-RNA相互作用预测方法研究[D];大连交通大学;2016年
9 刘济晗;三代RNA测序序列的比对和分析工具[D];哈尔滨工业大学;2018年
10 David Omar Ramirez Valle;单细胞RNA测序法鉴定先天淋巴细胞谱系[D];哈尔滨工业大学;2018年
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