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《上海海洋大学》 2018年
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催乳素在金钱鱼盐度适应过程中的机理研究

梁雪梅  
【摘要】:金钱鱼(Scatophagus argus)是一种广盐性经济海水鱼类,具有生殖洄游的特性。由于其兼具观赏价值和良好的经济效益,近年来深受我国南方地区水产养殖行业的青睐,属于海水养殖新对象之一。根据以往对金钱鱼的研究表明,该鱼种对水体环境的盐度变化具有非常强的适应能力,并且耐盐范围较宽,因此我们认为,为适应其生活史中所面临的环境盐度的剧烈变化,金钱鱼具备强而有效的渗透压调控机制以维持其机体内环境的稳定,是研究鱼类盐度适应性分子机制的非常理想的材料。内分泌系统是鱼类进行渗透压调节的主要途径之一,其中,催乳素(PRL)作为鱼类适应淡水环境时具有重要作用的激素,其行使功能的分子机制一直受到人们的关注。在本研究中,我们克隆获得了金钱鱼催乳素(saprl)及其两个受体(saprlr1和saprlr2)基因的全长c DNA序列,并对上述基因的表达模式进行了分析。在得到saprl基因全长c DNA序列的基础上,我们通过设计带有酶切位点的特异性引物并扩增获得目的片段后,选择p ET-28a(+)表达载体,成功构建了能够于体外表达PRL蛋白的重组质粒sa PRL-p ET28a(+)。该重组质粒在大肠杆菌(E.coli)中大量表达后对其进行纯化,可获得活性蛋白sa PRL。另外本研究通过进行体外实验,探讨了sa PRL与下游渗透压调控相关基因及离子转运之间的作用关系,为进一步研究PRL在渗透压调控中的分子机制提供理论基础。本研究主要结果如下:1、我们成功克隆获得了金钱鱼催乳素saprl及其受体saprlr1和saprlr2的c DNA全长序列。saprl的c DNA序列全长为1550 bp,ORF框为639 bp,可编码212个氨基酸(aa)。saprlr1 c DNA全长序列为2384bp,ORF框为1908 bp,可编码635 aa的氨基酸序列。saprlr2 c DNA全长序列为2495 bp,ORF框为1680 bp,可编码559 aa的氨基酸序列。经过氨基酸多重序列比对发现,saprl具有与其他物种共同的保守功能域,且在C-端具有高度保守的4个半胱氨酸残基(C)从而形成两个分子内二硫键。与哺乳动物相比,则在N-端有一段12-14 aa的缺失,其中包含一个二硫键;saprlr1和saprlr2的膜外域结构十分相似,均具有高度保守的WS结构以及4个保守的半胱氨酸残基(C)。而两者的膜内域结构存在较大差异,saprlr1具有保守的Box1和Box2结构域,而saprlr2仅具有Box1结构域。相似性分析均表明金钱鱼的这三个基因分别与黑棘鲷的这三个基因相似度较高。系统进化树结果显示saprl与鲈形目鱼类的prl聚为一支,而与哺乳动物的prl能够完全分开;saprlr1和saprlr2都与鲈形目的黑棘鲷prlr1和prlr2分别聚类为一支,且saprlr1与其他硬骨鱼类的prlr聚为一大支,并与非鱼类脊椎动物分开。组织分布分析表明,saprl基因仅在脑和垂体组织中有高丰度的表达;它的特异性受体saprlr1和saprlr2基因在主要渗透压调节器官鳃、肾脏、肠中均有高表达,推测sa PRL在金钱鱼中所行使的主要功能为参与渗透压调节。另外,我们在金钱鱼脑中发现其脑膜存在sa PRL蛋白的大量分布。不同盐度下,鳃或肾脏中的saprlr1和saprlr2在低盐组的表达量均显著高于高盐组,表明sa PRL激素及其受体对于金钱鱼适应长期低盐环境来说发挥着重要的作用。本章研究结果旨在为后续研究提供一定的理论基础。2、金钱鱼经过急性低渗胁迫后,脑中sa PRL的蛋白表达量与血清PRL含量都会在短期内发生显著上调,说明PRL在低渗刺激下能迅速合成与分泌,是金钱鱼适应低渗环境时的急性应答激素。另外,将金钱鱼转移至淡水环境而不影响其生存与活力的现象也可能与PRL、GH两种激素在此过程中的协同作用相关。金钱鱼saprlr1基因在鳃和肾脏中的表达量均会由于受到急性低渗胁迫而在短期内极显著上调,推测该基因参与了金钱鱼适应低盐环境的渗透压调节过程并起到了关键的作用;而saprlr2表达水平被抑制则可能与需要维持金钱鱼高水平PRL的作用相关。本章研究证实了Ras/ERK信号转导通路能够参与鱼类遭受渗透胁迫后的应激反应。另外,低渗胁迫对于下游相关离子转运蛋白的研究表明,ncc表达量在低渗刺激下显著升高,提示其在金钱鱼适应低盐度水环境时起到了重吸收Na+和Cl-的作用;nkcc2的表达水平在鳃组织中无明显变化,而金钱鱼肾nkcc2的表达水平能够被显著上调,提示其同样行使了重吸收Na+和Cl-的作用,且该蛋白进行盐度胁迫应答时,其表达水平存在组织特异性;而cftr基因的m RNA表达水平会因低渗刺激而显著下降,提示其对于金钱鱼适应淡水环境可能起到了抑制Cl-分泌的作用。本章研究为更深入地了解sa PRL在金钱鱼适应急性低渗胁迫过程中所起到的作用提供了一定的理论基础。3、我们成功构建了sa PRL-p ET28a(+)原核表达质粒。在含sa PRL-p ET28a(+)的宿主菌中加入IPTG至终浓度1 mmol/L,以32℃诱导4 h后,能获得大量重组蛋白的表达,此为sa PRL重组蛋白的最优诱导表达条件。通过低温诱导表达(IPTG终浓度为0.5 mmol/L,16℃诱导过夜),我们能够获得可溶性的sa PRL重组蛋白,为后续研究奠定了基础。4、在本章节中,我们通过使用提纯的sa PRL重组蛋白溶液处理金钱鱼鳃原代细胞(SG细胞)和肾原代细胞(SK细胞),试图进一步了解金钱鱼sa PRL对其特异性受体和下游离子通道蛋白NCC、NKCC2和CFTR的作用。研究结果表明,500 ng/m L sa PRL重组蛋白处理SG细胞和SK细胞3 h后,相关基因的表达量均会发生变化,并且经过大约24 h后均恢复原来的表达水平。sa PRL重组蛋白的处理能够上调SG细胞和SK细胞中saprlr1、saprlr2以及ncc基因的表达量,并且当sa PRL重组蛋白的终浓度≥100 ng/m L时,呈现显著或者极显著差异。另外,sa PRL重组蛋白的处理对SG细胞中nkcc2基因的表达量无显著影响,而当sa PRL重组蛋白的终浓度为500 ng/m L时,能使SK细胞中nkcc2基因显示显著上调。实验结果显示,sa PRL重组蛋白能使cftr的表达量呈现下降趋势,但无统计学差异。因此根据上述实验结果分析,sa PRL对NCC和NKCC2在金钱鱼适应低盐度水环境时有直接作用,促使金钱鱼能够向机体内吸收Na+和Cl-;CFTR在金钱鱼适应淡水环境时可能起到了抑制Cl-分泌的作用,但其功能的行使与sa PRL的作用并无直接关联。
【学位授予单位】:上海海洋大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4

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