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《沈阳药科大学》 2007年
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板蓝根化学成分与多维指纹图谱研究

肖珊珊  
【摘要】: 板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根,具有清热解毒、凉血利咽之功效,临床上常用于病毒性疾病和细菌性感染疾病。本论文以板蓝根药材为研究对象,分别从LC/DAD/ESI/MS/MS成分分析、单体的制备和结构确认、含量测定、提取工艺优化、指纹图谱与多维指纹图谱和抗内毒素药理研究五方面进行实验,为提高板蓝根药材质量标准、合理利用药材资源提供依据。 一、板蓝根的化学成分研究 采用LC/DAD/ESI/MS/MS联用法,对板蓝根的化学成分进行定性分析。通过一级和二级质谱图解析,供试品与对照品色谱峰的保留时间和紫外光谱对比,鉴定了其中5种化合物,分别是:胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和告伊春。根据质谱解析和文献结果,认定了7种化合物,分别是:精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、依靛蓝酮、水杨酸、板蓝根木脂苷A和羟基靛玉红。比较板蓝根水提物和乙醇提取物之间的差别,证明水提物能更全面的反映板蓝根的内在化学成分,确定水提醇沉法为板蓝根研究的提取方法。 《中国药典》1995年版将十字花科植物马蓝(Baphicacanthus cusia (Nees) Brem.)作为南板蓝根入药,本实验利用LC/MS手段对马蓝根进行分析,紫外和质谱色谱图均显示,马蓝根与菘蓝根的成分存在很大差异。 二、板蓝根中告伊春的制备与确认 采用大孔吸附树脂对板蓝根水提醇沉物进行粗分离,经乙酸乙酯萃取,利用半制备液相色谱仪进行分离纯化获得单体,制得的单体经EI-MS、~1H-NMR和~(13)C-NMR分析,确认为告伊春,旋光分析显示其为消旋体。本方法操作简便、快速、产率高、纯度高、成本低,适于推广。 三、板蓝根中核苷类成分和告伊春的含量测定 建立了以甲醇和NaH_2PO_4-H_3PO_4缓冲液为流动相,等度洗脱同时测定板蓝根中尿苷、腺苷和鸟苷含量的RP-HPLC法。测得尿苷在0.0107~0.107mg·mL~(-1)范围内r=0.9996,平均回收率101.0%(RSD=1.3%);腺苷浓度在0.0101~0.101mg·mL~(-1)范围内r=0.9996,平均回收率98.6%(RSD=1.1%);鸟苷浓度在0.0106~0.106mg·mL~(-1)范围内r=0.9995,平均回收率98.8%(RSD=1.2%),为完善板蓝根药材质量标准提供新的依据。 采用该方法,测定了19批样品,发现核苷类物质的含量差异较大,甚至可达二倍以上。药材的种源、生长地域及生长环境的不同导致这种差异。 建立了板蓝根中告伊春的RP-HPLC含量测定方法,以甲醇-水(15:85,v/v)为流动相,测得告伊春的含量在0.0107~0.1284mg·mL~(-1)范围内r=0.9999,平均回收率102.2%(RSD=0.5%),该方法简便、快速、准确。16批样品的含量测定结果,发现药材中告伊春的含量与核苷的含量无正相关性。 四、板蓝根注射液生产工艺优化 利用均匀设计法和单因素考察法对板蓝根注射液生产中几项工艺指标进行优化,并对药材的粉碎程度、浸泡时间进行考察,结合实际生产,制定板蓝根注射液生产工艺。 五、板蓝根指纹图谱及多维指纹图谱研究 建立了板蓝根的梯度洗脱HPLC指纹图谱,为结合实际生产同时建立等度洗脱HPLC指纹图谱,为药材的质量控制方法奠定了基础。在板蓝根HPLC指纹图谱的基础上,对20批样品的色谱图进行聚类分析,梯度洗脱和等度洗脱聚类结果具有一致性。采用国家药典委员会的计算机辅助相似度评价系统(相似度评价系统)和混批样品建立两种共有模式,采用三种测度计算相似度,相同样品的梯度洗脱和等度洗脱相似度趋于一致。为全面反应药材化学成分,实现准确判别,推荐使用梯度洗脱进行指纹图谱分析。利用相似度评价系统计算相似度时,应与含量测定相结合,用双指标体系判定,以避免对含量低但相对含量关系类似的谱图的误判。分析结果表明,板蓝根药材指纹图谱的相似度大于0.9者为合格品。比较了板蓝根药材、中间体和注射液图谱间的相关性,还考查了相同填料不同品牌色谱柱对指纹图谱研究的影响。 本实验还建立了板蓝根的LC/MS指纹图谱,在质谱总离子流色谱图(TIC)中反映了紫外没有吸收的组分和混合组分对指纹图谱相似度的贡献,与液相色谱指纹图谱互为补充,更加全面地反映板蓝根药材的质量。选择6批板蓝根样品,以腺苷的萃取离子色谱峰为内参比峰,计算各色谱峰的相对峰面积,进一步计算样品的相似度。比较了各样品TIC相似度和紫外检测色谱图相似度,两种方法对样品的评价趋势基本一致。 六、板蓝根抗病毒和抗内毒素活性研究 1.抗病毒实验对三个主要成分做了体外抗病毒药理实验,经实验证明,尿苷、鸟苷、腺苷有抗A1型流感病毒(H1)和抗腺病毒Ⅲ型(adv-3)的作用,为寻找板蓝根水溶性抗病毒成分做了初步的探索。 2.抗内毒素实验四项药理实验显示,板蓝根具有较强的抗内毒素作用,对内毒素诱导的发热和急性肝损伤有预防和保护作用。 (1)家兔发热实验板蓝根总提物和告伊春粗提物经腹腔注射给药后,对内毒素致发热既有预防作用又有保护作用,能显著降低家兔体温,对机体起到保护作用。实验结果表明,板蓝根总提物降温效果优于告伊春粗提物。 (2)小鼠急性肝损伤实验板蓝根总提物和告伊春粗提物对内毒素致小鼠休克/死亡有不同程度的保护作用,其保护作用与阳性对照组相近,甚至优于阳性对照组。内毒素诱导的小鼠急性肝损伤实验谷丙转氨酶测定结果与死亡率实验具有一致性,能进一步说明板蓝根对肝脏的保护作用。 3.告伊春的药动学研究以告伊春为指标,研究了板蓝根总提物和告伊春粗提物在家兔体内的药物动力学。血浆样品经二氯甲烷-异丙醇(4:1,v/v)萃取处理后,以乙腈-水(80:20,v/v)为流动相,流量1.0mL·min~(-1),对乙酰氨基酚为内标,经Diamonsil~(TM)C_(18)(4.6×250mm,I.D.5μm)柱分离。线性范围为0.123~4.90μg·mL~(-1),定量下限为0.123μg·mL~(-1)。7只家兔腹腔注射板蓝根总提物后的主要药动学参数T_(max)为0.4±0.2 h,C_(max)为1.61±0.44μg·mL~(-1),t_(1/2)为1.67±0.52h,AUC_(0-1)为4.24±1.09μg·mL~(-1);家兔腹腔注射告伊春粗提物后的主要药动学参数T_(max)为0.4±0.2h,C_(max)为2.66±0.44μg·mL~(-1),t_(1/2)为1.88±0.48h,AUC_(0-1)为7.51±1.40μg·mL~(-1)。除因给药剂量不同造成的C_(max)值不同外,T_(max)、t_(1/2)、MRT值t检验分析均无显著性差异。药物动力学分析为板蓝根更深入研究提供了依据。
【学位授予单位】:沈阳药科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R284

【参考文献】
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