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《山西农业大学》 2018年
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绿豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化及抗豆象机理研究

樊艳平  
【摘要】:胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor,TI)是一类对胰蛋白酶有抑制作用的多肽或蛋白质,在豆类作物种子中含量较高,不仅有抗虫作用,还有抗病毒、抗肿瘤的作用。因此寻找新型的、高活性的胰蛋白酶抑制剂具有重要的理论价值和应用价值,而目前有关胰蛋白酶抑制剂的研究主要集中在大豆、红豆等少数几种豆子中,关于抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂(Mung bean trypsin inhibitor,MBTI)的活性高低以及杀虫机理还未见报道,为此,本研究以不同绿豆为试验材料,进行了绿豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化和稳定性的研究,筛选出具有较强活性的绿豆胰蛋白酶抑制剂,并进行了抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫体内蛋白酶、代谢酶、保护酶活性以及生长发育的研究,旨在明确抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性以及抗豆象的杀虫机理,以期为抗虫绿豆资源的开发利用提供理论依据。研究结果如下:1、绿豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性试验表明:不同温度、不同pH、不同振幅超声波、不同高温高压、不同变性剂和不同还原剂对5个绿豆品种胰蛋白酶抑制剂残余活性均有一定影响,且处理时间越长,影响越大。其中抗虫绿豆B18、B20是绿豆胰蛋白酶抑制剂稳定性较高的2个品种,应用价值较大。2、绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化试验表明:绿豆胰蛋白酶抑制剂粗提的最适提取剂为氯化钠溶液,最适提取时间为12h,其中抗虫绿豆B18胰蛋白酶抑制剂粗提物中蛋白质含量、总活力和比活力均最高,分别为96.252 mg、553.738 U和5.753 U/mg。选取最适硫酸铵饱和度为60%时对其进行沉淀,得到的粗蛋白通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析后分离纯化出胰蛋白酶抑制剂纯品,得出抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂活性明显高于感虫品种,其中B18的胰蛋白酶抑制剂比活力和纯化倍数最高,分别为88.766 U/mg和14.641倍,B20次之,同时检测出5个绿豆品种中胰蛋白酶抑制剂的分子量约为8.8KDa。3、蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫体内蛋白酶活性的影响表明:在离体条件下,供试蛋白酶抑制剂(MBTI、PMSF、TLCK和OI)对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有一定的抑制作用,其中以20 ug/mL的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强;绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,体内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,随龄期的延长,3种酶活性均有所升高但仍显著低于对照,且均以MBTI的抑制作用最强。4、不同龄期绿豆象幼虫体内酶活性测定表明:绿豆象幼虫取食MBTI含量为2.0%的人工绿豆后对各龄期幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用最强,而对幼虫体内CarE和GSTs活性的诱导作用最强。取食MBTI含量为2.0%的人工绿豆后对各龄期绿豆象幼虫体内SOD和CAT活性的抑制作用最强,而对幼虫体内POD活性诱导作用最强。5、连续多代绿豆象生长发育及幼虫体内解毒酶、保护酶活性测定表明:绿豆象幼虫连续4代取食含MBTI的人工绿豆后,幼虫体重和成虫羽化率均有显著降低,而发育历期均明显延长,对幼虫体内CarE、GSTs和POD活性均有显著诱导作用,对幼虫体内SOD和CAT活性均有显著抑制作用。至第4代时MBTI对其幼虫体重、成虫羽化率和发育历期的影响均达最高;对幼虫体内CarE、GSTs和POD活性的诱导作用,分别于第2代、第4代和第3代达到最强;对SOD和CAT活性的抑制作用,分别于第1代和第3代达到最强。抗虫绿豆胰蛋白酶抑制剂活性明显高于感虫品种,其中B18、B20是绿豆胰蛋白酶抑制剂活性较高的2个品种,应用价值较大。绿豆胰蛋白酶抑制剂可通过抑制绿豆象幼虫体内蛋白酶、解毒酶和保护酶活性而影响绿豆象幼虫的正常生长发育,这将为绿豆胰蛋白酶抑制剂抗虫机制的研究提供理论基础,为抗虫绿豆资源的开发利用提供科学依据。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS214.9

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