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《山西农业大学》 2018年
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可控表达pGH转基因小鼠制备及其功能研究

张建斌  
【摘要】:作为一个诱导基因表达调控系统,四环素(tetracycline,Tet)调控系统在基因工程中已开始应用于复杂的生物发生反应、机体的疾病及行为等。它已成为研究某一基因功能的有效工具,尤其在转基因小鼠的基因功能上,得到了广泛的应用。生长激素(growth hormone,GH)在不同物种中均具有促进性成熟,提高瘦肉率,改善饲料转化率等优点,但也存在副作用,在转生长激素基因的动物上尤为明显。这可能由于转GH基因动物,都是全身过表达GH基因,而且外源GH基因从胚胎期到成年都持续发挥生物学效应,其机体发育的异常很可能和GH在全身多个组织器官中的自分泌异常有关。在Tet调控系统中,诱导底物四环素的浓度与外源基因表达水平在一定范围内呈正相关,因此,可以通过控制四环素及其衍生物强力霉素(doxycycline,DOX)的有无、浓度高低来调控所导入的外源基因表达水平,进而认识所导入基因在不同水平及不同生长阶段的表达,了解其在动物生长发育中作用,进一步深入研究GH生物学功能。本研究采用分子生物学方法,构建了猪生长激素(porcine growth hormone,pGH)真核细胞可诱导表达载体,采用阳离子脂质体法转染到猪髋动脉内皮细胞(porcine iliac artery endothelial cells,PIEC),在细胞水平上对Tet调控系统的诱导效率和表达水平进行了验证。然后利用该载体以原核显微注射方法,将外源基因片段(pTTGH)直接注射到原核期胚,制备转基因小鼠并用蛋白质组学的方法对其功能进行了研究。主要结果如下:(1)成功构建了重组表达载体(pTTGH)。在成功构建重组载体pTRE-GH12的基础上,应用PCR扩增出TRE-GH12基因序列片段。然后,通过酶(SalI)切位点将其连接到pCAGGS-rtTA载体上,构建pTTGH载体。通过对酶切、测序,结果证明构建的pTTGH载体符合要求。将构建好的载体用阳离子脂质体法转染到PIEC细胞。经遗传霉素(G418)抗性筛选后,将强力霉素添加到培养液中进行诱导。然后,通过荧光定量PCR在不同时间检测猪髋动脉内皮细胞内pGH mRNA的表达水平;配制不同浓度的强力霉素,将其加入细胞培养液内,在mRNA水平上测定猪生长激素的表达效率及表达水平。结果说明,将强力霉素添加到细胞培养液内,经过12、24、36、48和60h的检测,外源生长激素的mRNA表达水平分别比对照组高4.21、6.79、73.27、34.29和30.07倍。在培养基中添加不同浓度(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μg/mL)的强力霉素,pGHmRNA表达量分别是对照组的9.87、11.45、26.87、30.09、36.77、47.84、46.87、41.23、35.27和29.87倍,处理组与对照组差异极显著(P0.01)。(2)将pTTGH质粒以原核显微注射方法制备转基因小鼠。以Southern鉴定为阳性的Founder鼠为基础扩繁培育,对转基因后代鼠在3~10周龄期间通过饮水中添加诱导底物DOX进行诱导实验。结果表明,转基因小鼠体重在诱导期内持续增加,生长速度高于转基因小鼠无药物诱导组和非转基因对照组,转基因组小鼠血清中pGH水平远远高于对照组小鼠,差异显著(P0.05)。ELISA方法测定血清样本中内源IGF-1的表达水平,结果表明,转基因小鼠血清中胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)水平明显上升,说明外源GH通过调节IGF-1调节动物机体的生长。通过对转基因小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌、腿肌等组织进行形态学变化及病理学观察。苏木精和伊红染色法(hematoxylin-eosin,HE)切片结果表明:转基因小鼠加DOX诱导之后与同窝非转基因小鼠加DOX诱导之后相比,功能性器官肝脏、脾脏、肺脏、肾脏都没有发生可见病变。(3)通过对转基因小鼠和对照组小鼠大脑、肝脏和肌肉共6个组织样本,采用同位素标记相对与绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术进行质谱鉴定试验,再对获得的蛋白质组学数据进行生物信息分析,进而鉴定过表达GH转基因小鼠对机体的影响,进一步为GH高表达对大脑发育、能量代谢和生长性状的分子机制提供理论依据。转基因和对照组小鼠大脑组织共得到360个DEPs,转基因组高表达蛋白148个,低表达蛋白242个。肝脏组织共得到170个DEPs,转基因组高表达蛋白74个,低表达蛋白96个;肌肉组织比较共得到390个DEPs,转基因小鼠高表达蛋白156个,低表达蛋白234个。通过GO(Gene Ontology)注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析差异蛋白主要富集在RNA剪切过程、细胞间蛋白转运过程、mRNA加工过程及胰岛素信号通路、AMPK通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路等信号通路中。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q78

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