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《山西农业大学》 2018年
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镰孢菌与寄主互作中致病相关基因生物信息分析及表达研究

畅引东  
【摘要】:本论文运用形态学和分子生物学的鉴定分析方法,对采集自山西省不同地区的番茄枯萎病罹病植株中所分离的镰孢菌进行了病原种类鉴定和遗传多样性分析;运用生物信息学的方法,利用STRING蛋白互作网络数据库、Cytoscape软件和DAVID在线分析工具,构建了尖孢镰孢菌番茄专化型菌株不同致病因子的蛋白互作网络,并对预测的相关基因进行了分析;基于生物信息学的分析结果,采用实时荧光定量PCR法,对选取的尖孢镰孢菌番茄专化型的枢纽基因、致病相关功能基因、pri-milRNAs、milRNAs靶基因和番茄病程相关基因进行基因表达研究。旨在明确引起山西省番茄枯萎病害的主要病原种类及其遗传分化特征、病原菌侵染寄主时所涉及枢纽基因的互作调控机制及生物学功能以及尖孢镰孢菌侵染寄主相关基因的分子功能及调控机制等。此外,本论文还采用形态学观察、致病性测定和分子标记等方法,对禾谷镰孢菌和层出镰孢菌继代培养菌株的生物学特性和遗传多样性进行了研究,以探寻野生菌株继代培养对菌株遗传变异的影响。主要研究结果如下:1.山西省番茄枯萎病的病原共有4种,分别为尖孢镰孢菌、茄病镰孢菌、轮枝镰孢菌和串珠镰孢菌胶孢变种。其中,尖孢镰孢菌在山西番茄枯萎病罹病植株中的分离频率为53.3%,显著高于其它菌种,为主要病原菌。首次发现串珠镰孢菌胶孢变种亦是引起番茄枯萎病的病原菌。2.番茄枯萎病罹病植株中分离的56株尖孢镰孢菌中,尖孢镰孢菌番茄专化型共检测出3个生理小种,其中1号生理小种为优势小种。首次在我国番茄枯萎病罹病植株中发现3号生理小种。3.56株尖孢镰孢菌的遗传多样性研究结果表明,利用选取的引物可明确将供试的尖孢镰孢菌中番茄专化型菌株与非番茄专化型菌株区分开,但并不能明确的区分出尖孢镰孢菌番茄专化型的1号、2号和3号生理小种。4.尖孢镰孢菌番茄专化型的致病基因、碳水化合物活性酶、转录因子、脂酶、ABC载体、G偶联蛋白受体等各个致病因子的蛋白互作网络反映出的互作关系表明,各个致病因子在蛋白互作网络中,蛋白互作的程度存在明显差异,其中G偶联蛋白受体的蛋白互作较为紧密;在各个蛋白互作网络中,各自的核心模块间的互作也各有差异;蛋白互作网络各核心模块基因所涉及的生物学过程、分子功能和细胞组分等直接反映出该蛋白互作网络的生物学功能;研究发现,一些参与共同生物学过程的基因在多个蛋白互作网络中出现,反映出生物体的生物学过程是一个统一的整体,需要共同基因的参与。.5.基于生物信息学分析结果,获得尖孢镰孢菌番茄专化型致病枢纽基因,并构建了该菌株的致病蛋白互作网络及其核心模块。经DAVID工具进行功能富集分析表明筛选的枢纽基因主要参与了细胞间信号转导。6.尖孢镰孢菌番茄专化型菌株侵入番茄前后不同时期的病原致病相关基因和番茄病程相关基因的基因表达分析结果表明,病原菌的FOXG_13835、FOXG_04162和FOXG_06022等基因在病原侵染寄主初期参与到病原自身防御过程中;FOXG_08410、FOXG_08140、FOXG_04346、FOXG_08598、FOXG_03382、FOXG_08517 和 FOXG_12803等基因与病原菌株的初侵染定植紧密关联;FOXG_00154和FOXG_00893基因与菌株在番茄植株内的扩展相关;番茄NM_001288651、XM_004238172、XM_004245506和AW154864.1等基因参与了番茄对病原菌的抗性反应。7.尖孢镰孢菌番茄专化型菌株milRNAs与靶基因间的蛋白互作网络表明milRNA_1、milRNA_2、milRNA_3和milRNA_8的靶基因间互作较为紧密,其中,两个靶基因FOXG_04240和FOXG_03470能够同该蛋白互作网络中诸多的基因进行互作,推测为该蛋白互作网络中的枢纽基因;该蛋白互作网络主要分子功能为氧化还原酶活性,主要参与的生物学过程为小GTP酶介导的信号转导。8.尖孢镰孢菌番茄专化型pri-milRNAs与靶基因在侵染寄主前后的基因表达结果表明,供试的 fox_milRNA_2a 和 fox_milRNA_2b 与 FOXG_03470、fox_milRNA_3b 与FOXG_04910、fox_milRNA_4 与 FOXG_08812、fox_milRNA_6 与 FOXG_00067 基本呈负调控关系;FOXG_03470和FOXG_04910在菌株初侵染过程中起到重要的作用。9.经继代培养的禾谷镰孢菌的菌丝生长速度下降、产孢量上升、致病力下降,表现出明显的菌株退化现象,而经继代培养的层出镰孢菌的菌丝生长速度略微下降,产孢量减少,但致病力无明显变化,未表现出明显的菌株退化现象;禾谷镰孢菌和层出镰孢菌不同代菌株的遗传多样性研究结果表明,两个菌种不同代菌株间遗传分化明显,但是ISSR分子标记所反映出的菌株间遗传分化与菌株间表现出的生物学特性无明显的相关性。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S432.44

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