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《山西农业大学》 2018年
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绵羊皮下脂肪小RNA组及miR-124-3p调控前体脂肪细胞分化的研究

潘洋洋  
【摘要】:MicroRNA(miRNA)是一种非编码的短链RNA。可通过与靶基因mRNA互补结合,抑制mRNA的转录过程或直接降解与之结合的mRNA,发挥对mRNA转录后调控的作用。miRNA在多种组织和器官的发育与代谢中发挥调节功能,miRNA也可以通过介导靶基因的表达,调控前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化过程,介导脂质积累和代谢等生理过程。前期研究主要集中于miRNA对模式生物脂肪细胞调控的研究,对于miRNA在绵羊脂肪组织中的调控作用不甚了解。研究miRNA在绵羊脂肪细胞分化和脂质积累中的功能和分子机制可对改善绵羊脂肪分布、提高胴体品质奠定理论基础。为探究miRNA对绵羊脂肪发育的影响,本研究首先利用高通量测序技术,对山西肉用绵羊母本品系(Shanxi Meat Sheep Dam Line,SMD)和小尾寒羊(Small Tailed Han STH)皮下脂肪组织的miRNA表达进行检测。使用荧光定量PCR技术验证测序数据的准确性。通过生物信息学方法识别在测序样品中表达的已知miRNA和未知miRNA,随后分析这些miRNA在STH和SMD测序文库中的差异表达特征。使用靶基因预测软件预测两文库中差异表达的miRNA的靶基因,使用Gene Ontology和KEGG数据库对靶基因的潜在作用进行富集分析。挑选在两文库中高表达且表达存在显著差异性的miR-124-3p作为研究对象,在细胞水平观察miR-124-3p对脂肪源前体脂肪细胞和肌肉源前体脂肪细胞分化的影响。为验证miR-124-3p与潜在靶基因C/EBPα和BCKDHA的结合情况,构建了这两个基因mRNA3,-UTR的双荧光报告载体,在293T细胞中观察miR-124-3p对荧光报告载体荧光活性的影响。此外,还构建了BCKDH 过表达和沉默表达质粒,使用慢病毒包装的方法构建慢病毒干扰表达系统。通过在肌肉源前体脂肪细胞中过表达或抑制表达BCKDHA,对支链氨基酸代谢关键基因BCKDHA在脂肪生成和支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)代谢中的功能进行了探究。本研究的主要结果如下:(1)通过对两品种(系)绵羊皮下脂肪组织中miRNA表达量进行高通量测序,分别在小尾寒羊和山西肉用绵羊母本品系皮下脂肪中检测到11264198和14715022条clean reads。随后将clean reads比对到NCBI和miRBase数据库,分别在两个测序文库中识别出121种和119种已知miRNA,以及163种和184种未知miRNA。对miRNA的表达进行差异分析后,发现有43种已知miRNA和117种未知miRNA在STH和SMD测序文库之间显著差异表达。对两文库中差异表达的已知miRNA和未知miRNA分别进行靶基因预测,发现这些已知miRNA存在297964个潜在靶基因,未知miRNA存在425278个潜在靶基因。随后对两品种(系)绵羊皮下脂肪组织中的miR-103、miR-107、miR-124-3p、miR-191、miR-221、novel-miR-42 和 novel-miR-121 进行荧光定量 PCR 检测,验证此次miRNA-seq检测结果的准确性。发现经荧光定量PCR技术检测的七个miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致,说明本次高通量测序结果较为可靠。(2)基于上述高通量测序数据,从中挑选出在两文库中表达量较高且表达存在显著差异的miR-124-3p,对其在脂肪细胞分化过程中的作用进行了研究,并探讨了miR-124-3p对成脂相关信号通路的影响。通过生物信息学预测发现C/EBPα和BCKDHA mRNA3'-UTR存在miR-124-3p的结合位点。经过双荧光报告技术表明miR-124-3p可显著降低含有3'-UTR的双荧光报告载体的荧光强度。在体外分离培养绵羊脂肪源和肌肉源前体脂肪细胞,在这两种前体脂肪细胞中过表达或沉默表达miR-124-3p,并对细胞诱导分化,发现miR-124-3p的过表达抑制了这两种前体脂肪细胞的分化,表现为脂滴形成减少,同时两个潜在靶基因C/EBPα和BCKDHA在mRNA水平和蛋白水平表达量均显著下调,且脂肪分化标志基因的表达量降低。miR-124-3p表达沉默的细胞则呈现相反的结果。(3)通过构建BCKDHA基因的慢病毒过表达和沉默表达系统,在肌肉源前体脂肪细胞中过表达或沉默BCKDHA,并诱导细胞进行分化。发现过表达BCKDHA后,细胞分化能力增强,从细胞培养液中摄入支链氨基酸的速率提高,且分化标志蛋白的表达量上调。沉默表达BCKDHA后各项指标与过表达相反。说明BCKDH4可通过调控支链氨基酸的代谢,对绵羊肌肉源前体脂肪细胞的分化产生促进作用,本研究通过对绵羊皮下脂肪组织中miRNA表达谱的分析,寻找对绵羊脂肪代谢具有潜在调控功能的miRNA。对miR-124-3p在皮下脂肪和肌内脂肪形成中的功能进行了体外验证,并对其作用机理进行了研究。本研究可为理解miRNA在不同部位脂肪组织形成中的功能提供参考,为减少绵羊皮下脂肪、增加肌内脂肪提供科学依据。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S826

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