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《山西农业大学》 2018年
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microRNA-5110共靶Wnt1和MLPH调控黑色素细胞内色素沉积的作用机制研究

杨姗姗  
【摘要】:色素沉积包括黑色素细胞产生黑色素和黑色素转运到周围角质形成细胞这两个过程。色素沉积过程复杂,现已发现多个基因和microRNAs调控该过程。前期对不同毛色羊驼皮肤microRNAs的表达谱分析发现microRNA-5110呈差异表达,可能与毛色形成相关。本研究通过生物信息学分析,靶基因验证,microRNA-5110调控黑色素生成和转运的研究,运用双荧光报告试验,荧光定量PCR试验,蛋白免疫印迹试验,组织免疫化学与细胞免疫化学试验,原位杂交试验及深度测序试验,揭示microRNA-5110在黑色素沉积机制的调控作用。试验内容和结果如下:1.运用miRBase和TargetScan靶基因生物信息学分析发现microRNA-5110的靶向基因有Wnt1和MLPH,经靶基因3'-UTR双荧光报告载体和microRNA-5110过表达载体在293T细胞中共表达后,双荧光素的活性分别为对照组的0.53倍和0.42倍。因此,推测Wnt1和MLPH为microRNA-5110的两个靶向基因。2.在羊驼黑色素细胞中,转染microRNA-5110后,经real-time PCR和western blotting方法检测microRNA-5110转染羊驼黑色素细胞后靶基因Wnt1、MLPH,主要色素调控基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2,与黑色素颗粒转运相关基因Rab27a、Myosin Va的mRNA,蛋白水平以及黑色素含量的变化。实验结果显示,microRNA-5110过表达下调 Wnt1、MLPH、MITF、TYR、TYRP1、Rab27a 和 Myosin Va 基因 mRNA 表达,而上调 TYRP2mRNA 表达;microRNA-5110 过表达下调 Wnt1、MLPH、MITF、TYR、TYRP1、Rab27a和Myosin Va蛋白水平,但是TYRP-2蛋白水平相对上调;microRNA-5110过表达引起总黑色素含量和褐黑素含量明显下调,真黑色素含量明显上调。因此,推测microRNA-5110参与黑色素形成和转运的调控。3.建立microRNA-5110转染共培养的黑色素细胞与角质形成细胞后,Fontana-Masson染色发现黑色素细胞和角质形成细胞内黑色素颗粒明显减少;皮下注射microRNA-5110过表达载体后,小鼠毛色表型变浅。microRNA-5110转基因小鼠皮肤中MITF、TYR、TYRP1、Rab27a 和 MyosinVa 基因 mRNA 表达低于正常组小鼠,TYRP2 mRNA高于对照组:microRNA-5110转基因小鼠皮肤中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白水平低于对照组,microRNA-5110转基因小鼠总黑色素和褐黑色素含量明显低于对照组,而真黑色素含量明显高于对照组。因此,推测microRNA-5110参与动物毛色形成和转运的调控。4.为了尽可能的发现黑色素颗粒合成和转运机制,对过表达microRNA-5110的黑色素细胞进行了深度测序。结果显示:四个分子路径即黑素原生成途径,MAPK途径,Wnt信号途径和cAMP信号途径表达差异。其中有48个为上调基因,212个基因为下调基因。荧光定量分析 DKK1,gp10O,IGF1R,CDK5,Ednrb,Kitl,Myc 和 sGC 的 mRNA表达差异及MAPK信号通路mRNA表达差异,其结果与RNA测序结果相一致。5.运用real time PCR,western blotting及组织免疫化学实验,检测cAMP信号途径中鸟氨酸环化酶(sGC)在白色与黑色绵羊皮肤中的表达差异。结果显示,sGC mRNA和蛋白在黑色绵羊皮肤中的表达量显著低于白色绵羊皮肤;组织免疫化学结果显示:在白色绵羊皮肤中sGC阳性反应分布在毛乳头上方;在黑色绵羊皮肤中sGC阳性反应分布在毛乳头及外根鞘。pGLO-sGC转染绵羊黑色素细胞后,MITF,TYR,TYRP1和TYRP2的mRNA和蛋白相对表达量下调。结论:microRNA-5110通过靶向结合Wnt1和MLPH调控毛色基因MITF,TYR,TYRP1和TYRP2以及转运基因MyosinVa和Rab27a的表达而影响小鼠毛色表型变化。microRNA-5110在黑色素细胞中参与多条信号路径,其中sGC是潜在的被调控基因之一,在黑色素细胞中受microRNA-5110的调控。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S813.1

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