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《山西农业大学》 2018年
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蜜蜂AFP基因的差异表达及个体抗寒机制初探

徐凯  
【摘要】:抗冻蛋白基因(Antifreeze protein,AFP)是当前昆虫抗寒性研究中的热门候选基因。该基因能够非依数性地降低昆虫血淋巴冰点而对熔点无显著影响,进而提高昆虫对低温环境的适应性以及存活率。迄今为止,关于膜翅目昆虫抗冻蛋白表达特性及蜜蜂个体抗寒机制的研究未见报道。本研究通过对不同温度处理后的中蜂工蜂个体进行转录组分析,从而探究蜜蜂体内抗寒相关的候选基因。对25℃、10℃和0℃处理后中蜂和意蜂体内葡萄糖、甘油以及氨基酸含量进行测定,从而探究与蜜蜂抗寒相关的生理指标。利用基因克隆获得中蜂和意蜂AFP基因序列,并利用荧光定量PCR技术检测两蜂种不同发育时期、不同组织以及不同性别中AFP mRNA的表达差异。利用荧光定量PCR和Western blot技术测定两蜂种在不同低温胁迫处理下AFP的表达量,将其表达量与同处理下各抗冻保护剂的浓度进行关联分析。通过体外饲喂dsRNA的方法对中蜂和意蜂体内AFP基因进行RNA沉默,检测沉默前后两蜂种体内其他抗寒相关蛋白基因的变化。通过差示热力扫描仪对中蜂AFP基因RNAi前后血淋巴液的热滞活性进行测定,结合原核表达所得中蜂抗冻蛋白的热滞活性检测结果,初步推测中蜂抗冻蛋白的生理功能。本研究得出的主要结果如下:(1)不同温度处理后的中蜂工蜂个体间存在501个差异表达基因。差异表达基因的GO分析结果表明,各差异表达基因参与了小分子物质(糖和游离氨基酸)的生物合成和代谢、钙通道活性调节和以及微管细胞骨架的稳固等生命活动。此外,还有一些大分子的抗寒相关的蛋白质家族成员(HSPs、STKs和ZFPs)的表达量在不同温度处理组间存在显著差异。(2)中蜂和意蜂体内葡萄糖、甘油以及氨基酸的含量在不同温度处理组间均存在显著差异。在低温环境下,中蜂在依赖葡萄糖代谢的程度上高于意蜜蜂,而意蜂体内甘油积累程度远远高于中蜂,中蜂体内参与抗寒功能的氨基酸种类为17种,高于意蜂的15种,而且各氨基酸在两蜂种不同温度处理组间的变化也存在一定差异。(3)中蜂和意蜂抗冻蛋白基因均包含长度为1095 bp的ORF区且编码364个氨基酸,AcerAFP和AmelAFP均包含信号肽但无跨膜结构域,两序列蛋白理化性质均为具有稳定结构的中性且亲水性的蛋白质,两序列的相似性在94%以上,且在蛋白结构上具有较高的相似性。AFPmRNA高表达于中蜂发育前期,而高表达于意蜂发育后期。AFP在两蜂种运动器官(足、胸部和翅膀)中的表达量较高。AFP在两蜂种不同性别个体间的表达量存在显著差异且两蜂种间的表达趋势完全相反。(4)中蜂和意蜂AFP的表达受低温和胁迫时间的诱导,且两蜂种间该基因的表达趋势存在显著差异。中蜂和意蜂AFP的表达与蜜蜂体内葡萄糖、甘油以及多种氨基酸的浓度显著相关。中蜂和意蜂抗冻蛋白基因沉默后多数的抗寒相关蛋白家族基因的表达量发生了显著的变化。此外,本研究初步推测中蜂抗冻蛋白通过降低蜜蜂血淋巴液的完全结冰温度来提高个体的抗寒性。综上所述,蜜蜂个体通过调控糖和游离氨基酸的生物合成和代谢、钙离子通道活性以及微管细胞骨架等生理过程来提高抗寒性。蜜蜂体内存在“葡萄糖-甘油-氨基酸”的的抗寒物质系统。蜜蜂抗冻蛋白在不同蜂种间的表达存在较大差异,可能与不同蜂种的生物学特性和抗寒性的差异密切相关。上述结果为蜜蜂个体抗寒机制和AFP基因功能的进一步研究奠定基础,也为蜜蜂抗寒新品系的培育提供理论依据。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S891

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