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《山西农业大学》 2018年
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小鼠黑色素瘤(B16)转录、lncRNA表达分析及B16纳米文库构建

姬凯元  
【摘要】:黑色素瘤是由黑色素细胞癌化形成的一种最具侵袭性的发生于皮肤部位的恶性癌症,研究黑色素瘤转录特点、lncRNA表达特点等对其治疗具有十分重要的意义。重链抗体,一种存在于羊驼、骆驼、软骨鱼血清中的一种特殊结构的微小抗体。与传统的四联体抗体相比,重链抗体只含有两条重链,结构简单、性质稳定。基于重链抗体的基础上科研人员研发出一种结构更加简单,性质更加稳定,分子量更小的VHH抗体(纳米抗体),纳米抗体因其优良的特性在疾病诊疗方面具有显著的优势。本实验采用二代测序技术对分离自C57BL-6J小鼠的正常黑色素细胞及黑色素瘤(B16)细胞进行二代测序,分别检测两种细胞基因的转录组差异,长链非编码RNA(lncRNA)表达差异,由此筛选特异性表达的基因进行功能研究,探索黑色素瘤疾病的发生机制,同时建立特异性的B16细胞蛋白纳米抗体免疫文库,为后续研发B16检测及治疗抗体提供基础。1.正常黑色素细胞及B16细胞转录组测序分析:使用EBSeq软件对mRNA测序数据采用差异倍数(Fold Change)大于等于2且错误发现率(FDR0.05)作为筛选标准,共得到4086个差异基因;KEGG数据库对4086个差异基因进行注释,发现4086个差异基因分属于146个调控通路;根据注释结果随机挑选9个跟癌症相关的差异基因采用定量PCR(qRT-PCR)法进行验证,结果与测序结果趋势一致;挑选与黑色素生成及黑色素细胞迁移和增殖相关的基因采用定量PCR及Western blotting法进行验证,结果都与测序趋势一致。2.正常黑色素细胞及B16细胞lncRNA测序分析:通过差异倍数及错误率筛选,从两组样品的测序数据中共得到373个差异表达的lncRNAs,其中136个lncRNAs在B16细胞中表达量显著上调,237个lncRNAs在B16细胞中表达量显著下调;定量PCR检测表达量差异最显著的6个lncRNAs,检测结果与lncRNA的测序结果趋势相同;两种预测方法(lncRNA-cis-target 和 lncRNA-lucTar-target)对差异表达的373个lncRNAs进行靶基因预测,共筛选得到467个潜在的靶向调控基因。KEGG数据库对467个靶向调控基因进行注释,分析发现43个IncRNAs和靶基因与黑色素生成和黑色素瘤通路有关;筛选发现lncRNA-13317.1在理论上可以靶向调控BRCA1,通过双荧光报告载体实验验证了这一结果,而BRCA1基因在细胞损伤后的修复过程中发挥着重要的作用,由此证明lnc-13317.1也参与细胞的损伤修复过程;细胞增殖实验发现lnc-MSTRG.13317.1可以通过调控靶基因BRCA1进而调控黑色素瘤细胞的增殖。3.通过转录组测序分析发现TAK1基因在B16细胞中异常性低表达,miRBase数据库分析发现:B16细胞中异常性高表达的lnc-MSTRG.5423 8.1可能是miR-143-5p的前体,文献报道正常小鼠及B16细胞miRNA测序发现miR-143-5p在B16细胞中异常性高表达,miR-143-5p在黑色素瘤细胞增殖方面具有十分重要的作用,但关于miR-143-5p在正常黑色素细胞中的作用机制尚未见报道。本实验以羊驼黑色素细胞为载体,双荧光报告载体实验确定了miR-143-5p和TAK1的靶向调节关系;过表达miR-143-5p后发现羊驼黑色素细胞的黑色素产量显著下调;细胞增殖实验发现miR-143-5p可以上调羊驼黑色素细胞的增殖;细胞划痕实验发现miR-143-5p可以促进羊驼黑色素细胞的迁移。4.反复冻融法与超声破碎法相辅助裂解B16细胞获得B16细胞的全蛋白,免疫选取体况良好的成年雄性羊驼,采用pCANTAB5e噬菌体展示技术构建B16全蛋白纳米抗体cDNA文库,梯度稀释检测库容达到5.76 × 1010个,梯度稀释检测文库丰度达到3.65 ×1010个/ml,随机挑选50个单克隆对文库插入率进行检测,结果发现50个样品中只有两个样品插入的不是VHH片段,文库插入率达到96%,以上结果说明构建的B16全蛋白纳米抗体文库质量良好,可用于后续研发B16细胞的纳米抗体。结论:本研究通过对C57BL-6J小鼠正常黑色素细胞及B16细胞深度测序分析,共筛选到4086个差异表达的mRNA,并对其进行了调控通路注释;通过对两种不同细胞的lncRNA测序分析,共得到373个差异表达的lncRNAs,同时通过对其靶基因进行功能注释,筛选得到43个与黑色素产生及癌症相关的lncRNA,为后续研究lncRNA对黑色素细胞癌化机制奠定了基础;通过对差异mRNA及差异lncRNA进行功能关联,筛选得到了在黑色素瘤细胞中具有重要功能的miR-143-5p,本研究以羊驼皮肤正常黑色素细胞为载体探索了miR-143-5p在正常黑色素细胞中的生物学功能;通过噬菌体展示技术构建了B16细胞全蛋白纳米抗体文库,为后续研发B16纳米抗体奠定了基础。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R739.5;R-332

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