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《山西农业大学》 2018年
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中华蜜蜂气味受体基因Or1和Or2功能分析

郭丽娜  
【摘要】:昆虫嗅觉是由多种蛋白分子参与的复杂的化学信号传递过程。嗅觉参与昆虫的寻偶、觅食、交配、产卵、种群管理等多种生理活动并发挥至关重要的作用。中华蜜蜂Apis cerana cerana是我国特有的蜜蜂品种,其高度灵敏的嗅觉系统能在复杂的气味环境中识别群体内化学信号以及区分从食物源散发出的特异性气味分子,而蜜蜂识别气味分子的行为与其嗅觉系统中相关蛋白的功能有着密切的关系。本研究选用中华蜜蜂气味受体AcerOr1和AcerOr2作为研究对象,从中华蜜蜂体内外探讨了它们潜在的生物学功能,并对其可能参与的Ca2+/CaM/CaMKII信号通路,及其参与调控雄蜂精子活力进行了初探。本研究的主要结果如下:(1)通过饲喂法介导RNAi的方法对气味受AcerOr1和AcerOr2基因在中华蜜蜂体内的功能进行了初步探索。结果显示:饲喂dsRNA后能显著降低中华蜜蜂体内AcerOr1和AcerOr2 mRNA和蛋白质的表达水平,且AcerOr1沉默效果最好的是218 bp大小的短链dsRNA,而AcerOr2沉默效果最好的是471 bp的长链dsRNA。饲喂中华蜜蜂dsRNA后,对目的基因mRNA表达量干扰效果最佳的是第4天,但是RNAi的抑制效率持续到第9天效果仍很明显,说明dsRNA片段长短及作用时间对RNAi作用明显。触角电位的检测显示,干扰中华蜜蜂AcerOr1和AcerOr2后,也会影响其触角对VUAA1、丁香酚、1-壬醇等气味物质的感受能力,说明这两个基因表达缺失后能严重影响中华蜜蜂对气味物质的识别,初步验证了中华蜜蜂AcerOr1和AcerOr2所行使的功能。(2)通过将气味受体AcerOr1和AcerOr2构建真核表达载体后转染Sf9细胞,对其在异源细胞中的功能进行分析。蛋白序列预测发现AcerOr2蛋白质二级结构上包含有CaM结合位点和与离子通道相关的Tyr残基位点,而AcerOr1蛋白质二级结构上不含钙调蛋白结合位点和离子门控通道。重组后的真核表达载体转染Sf9细胞发现:AcerOr1既能和Sf9内源性Orco也可与AcerOr2结合在Sf9细胞膜形成具有气味配体门控通道作用的异源二聚体(ORX+Orcoheteromeric complex),当细胞受到外界气味化合物刺激后,能引起Ca2+内流。结果表明:AcerOr1对丁香酚、月桂酸、罗勒烯、1-壬醇、亚麻酸、乙酸己酯、十一酸、1-辛醇和亚麻酸9个化合物钙离子反应敏感,而AcerOr2只对VUAA1反应敏感。该结果一方面表说明Sf9细胞内存在内源性Orco的表达可以激活AcerOr 1对气味分子的反应,另一方面表明Orco能够起到协同的作用,有助于形成(Orco+AcerOr1)异源二聚体和(Orco+Orco)同源二聚体复合物。(3)通过定点突变将预测的AcerOr2钙调蛋白(CaM)结合位点突变后对其进行免疫荧光、免疫印迹检测,检测Ca2+及细胞内CaMKII表达量变化,探讨AcerOr2发挥功能与其CaM结合位点间的相互作用的关系。结果显示在体外转染AcerOr2的细胞受到共受体激动剂VUAA1和CaM抑制剂W7刺激后能显著影响Ca2+浓度,并能影响CaMKII蛋白表达量变化,而CaMKII的激活需要CaM与Ca2+共同作用,同时间接证明了 AcerOr2和CaM的相互作用的关系。由此推测AcerOr2可能介导了 Ca2+-CaM激酶信号通路,为研究CaM影响AcerOr2功能及进一步探讨Ca2+/CaM/CaMKII信号通路在昆虫嗅觉中的作用提供了基础。(4)通过 Real-time PCR 和 Western blot 检测,结果表明:AcerOr2、CaM、CaMKII和p-CaMKII在中华蜜蜂的精子和睾丸中均有表达,且在精子中的表达量显著高于睾丸中的表达量。添加AcerOr2激动剂VUAA1和CaM抑制剂W7对精液质量和精子DNA完整性均有一定的影响,且DNA完整性和精液参数之间存在正相关性。说明AcerOr2通过Ca2+/CaM/CaMKII信号途径相互作用参与精子的调控。本研究首次对中华蜜蜂气味受体AcerOr1和AcerOr2的功能进行了分析,初步验证了其在中华蜜蜂体内具有的潜在调控作用,为中华蜜蜂其他气味受体功能的研究奠定基础,同时为研究蜜蜂的嗅觉识别机制提供理论依据。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S891

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